內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮祖細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞的信號聯(lián)系在血管形成的時候是至關(guān)重要的。其中，外分泌體就是其中一種通信方式。有研究發(fā)現(xiàn)，外分泌體在免疫應(yīng)答，腫瘤存活，應(yīng)激反應(yīng)和血管生成上的細(xì)胞間通信有著非常重要的作用。在外分泌體中有mRNA和miRNA往往會對受體細(xì)胞產(chǎn)生影響。荷蘭的研究人員對外分泌體內(nèi)的microRNA miR-214的研究發(fā)現(xiàn)，含有miR-214的外分泌體能夠減少受體細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞的衰老，并且促進(jìn)血管生成的發(fā)生。與此同時，其還會減少毛細(xì)血管失調(diào)癥突變體 ataxia telangiectasia mutated (ATM)的表達(dá)。
研究人員采用毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞系（he human microvascular endothelial cell line (HMEC-1)），鋪在基質(zhì)膠上，采用添加/無外分泌體的培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時，對比不同條件下的小管長度。
（一）實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法
1）細(xì)胞： HMEC-1 (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA) 104 per well
2）培養(yǎng)基： MCDB 131 Medium (Life Technologies)
3）基質(zhì)膠： Matrigel (ECMatrix, Millipore) 10 µl per well
4）耗材： µ-Slide Angiogenesis, ibiTreat (ibidi, 81506) 1 Slide
5）其他： 細(xì)格紙 1 sheet
實(shí)驗(yàn)流程圖：
實(shí)驗(yàn)流程圖，提前將Matrigel融化，鋪于ibidi血管生成載玻片 µSlide Angiogenesis 的下孔中，待膠凝后，將細(xì)胞懸液加入血管生成載玻片上孔中，成管后使用顯微鏡觀察。
（二）實(shí)驗(yàn)步驟
1）準(zhǔn)備基質(zhì)膠
① 實(shí)驗(yàn)前一天將Matrigel置于冰盒中，放入4。C冰箱，使膠能過夜緩慢融化。（注意：同樣要準(zhǔn)備一些4。C預(yù)冷的槍頭用于吸取Matrigel）
② 開始實(shí)驗(yàn)前，將Matrigel始終保持放在冰盒中。
③ 打開滅菌包裝，取出ibidi血光生成載玻片 µ-Slide Angiogenesis。
④ 每孔中加入10μl Matrigel。注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。
怎么知道加了合適體積的Matrigel：
由于Matrigel流動性不強(qiáng)，并且有可能移液槍不準(zhǔn)確，有可能10μl的膠不能填滿ibidi血管生成載玻片的下孔，這樣，必然會影響到實(shí)驗(yàn)的成像結(jié)果。這時用一張格子紙就能知道移液槍調(diào)整到多少能正好把下孔填滿。
如上圖所示，垂直透過每個孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了，那么就說明膠沒加滿，格子被放大了，那么膠就加多了，格子沒發(fā)生什么變形，這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。
2）凝膠
① 蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。
② 準(zhǔn)備一個10cm的培養(yǎng)皿，放入浸過水的紙巾，制成一個濕盒。
③ 將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋。
④ 將整個培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，靜置30分鐘左右，等待膠凝結(jié)。
⑤ 等待同時準(zhǔn)備細(xì)胞懸液。
3）鋪細(xì)胞
加入細(xì)胞的量直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以在正式實(shí)驗(yàn)開始之前，要對不同類型的細(xì)胞和使用數(shù)量進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。獲得較好比例的細(xì)胞密度。使用HMEC-1細(xì)胞，每孔種10000個細(xì)胞即可。
① 準(zhǔn)備密度為2*105cells/ml的細(xì)胞懸液，充分混勻。
② 將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。
③ 每孔加入50μl的細(xì)胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠。可以使用排槍。
④ 同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體，如果沒有，加入無細(xì)胞的培養(yǎng)基，使上孔液體正好加滿。
⑤ 蓋上蓋，靜置，一段時間后，所有細(xì)胞都會沉下去落在Matrigel的表面。
4）不同培養(yǎng)基處理
采用無處理基礎(chǔ)培養(yǎng)基（basal,-），培養(yǎng)了HMEC-124小時后收集的培養(yǎng)基（cond,comp.）和在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入了分離出來的外分泌體的培養(yǎng)基（basal,+)分別加入血管生成載玻片中，37℃，培養(yǎng)18小時。
5）采集圖像并統(tǒng)計結(jié)果
可以按照細(xì)胞的生長速度定時采集圖像，并且對其成管長度測量和記錄，并且對其進(jìn)行統(tǒng)計分析。
三）實(shí)驗(yàn)結(jié)果
結(jié)果可見，18小時后，分別測量3組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的血管長度，統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，加入外分泌體的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和培養(yǎng)HMEC-1細(xì)胞24小時后收集的培養(yǎng)基的成管長度，顯著長于純的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的HMEC-1細(xì)胞的成管長度。說明，外分泌體對血管生成有著顯著的促進(jìn)作用。
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